發布時間：2023-07-17
2023年7月17日，《自然·方法》期刊在線發表了中國科學院腦科學與智能技術卓越創新中心（神經科學研究所）、神經科學國家重點實驗室陳躍軍研究組題為《利用CRISPR條形碼技術全面繪制小鼠腦內的單細胞時空譜系》的研究論文。該研究通過建立能夠應用于小鼠體內任意組織器官的譜系示蹤新技術——CREST，解析了小鼠中腦在胚胎發育過程中的單細胞時空譜系圖譜，揭示了小鼠中腦發育過程中新的譜系分化路徑和分子調控機制。CREST技術為高通量解析小鼠組織器官發育的單細胞譜系提供了全新的工具，為從譜系視角研究各種發育疾病的發病機制提供了新的研究工具。
哺乳動物的發育伴隨高度復雜的細胞命運特化過程——從多潛能干細胞逐步分化成熟為各種類型的細胞，進而形成高度異質性的組織器官。解析每個細胞在這一過程中的完整發育歷程（即“譜系”）是發育生物學領域的重要目標之一。譜系的研究有助于人們理解生命個體的發育，解析發育相關疾病的發病機制，并為基于細胞治療的再生醫學研究中不同類型細胞藥物的體外分化和制備，提供關鍵依據和線索。
近年來，人們為解析哺乳動物神經系統的譜系做出了巨大努力。然而，傳統基于重組酶技術的譜系示蹤通量有限，一般只能示蹤1-2個譜系。最近的一些研究通過在側腦室注射條形碼標記的病毒，對腦室區（Ventricular Zone，VZ）的神經干細胞進行標記，并結合單細胞測序對這些細胞的子代細胞進行高通量譜系示蹤。然而，這種方法只能標記VZ區的神經干細胞，無法實現對全腦任意腦區神經干細胞的標記，而且用病毒注射的方法標記早期胚胎中的細胞還存在技術障礙。因此，急需開發一種能夠對腦內任意細胞群體進行高通量條形碼標記和譜系示蹤的新方法。
陳躍軍研究團隊針對以上問題，通過將CRISPR條形碼技術、重組酶系統和單細胞測序技術相互結合，開發了一種在體高通量譜系示蹤的方法——CREST，并構建了相應的譜系示蹤工具小鼠品系（圖A）。利用CREST技術，研究團隊繪制了較全面的中腦發育譜系圖譜，有助于深入理解中腦多種類型細胞的發育過程。
研究團隊首先利用基于CREST的“快照”策略（snapCREST），解析了特定發育時間點中腦不同細胞類型之間的譜系關系（圖B），發現了許多先前未被報導的具有亞區特異性的譜系關系：在翼板中，谷氨酸能神經元與GABA能神經元具有共同的譜系起源；而在基板中，這兩類神經元具有相對獨立的起源；在底板中，谷氨酸能神經元則與多巴胺能神經元具有共同的起源（圖C）。研究團隊進一步在克隆水平對祖細胞的分化命運進行了無偏好的分類，發現單個中腦祖細胞的分化命運可以被分為六種主要類型。基于這一結果，研究團隊提出了“祖細胞原型”的概念，這六種中腦祖細胞原型囊括了中腦發育過程中單個中腦祖細胞的不同分化命運（圖D）。研究團隊進一步在克隆水平對中腦底板神經祖細胞的分化命運進行了分析，發現單個中腦底板神經祖細胞存在三種不同的分化命運：中腦底板神經祖細胞經由中腦底板神經母細胞，有的偏好分化成多巴胺能神經元，有的偏好分化成谷氨酸能神經元、有的則能同時分化成多巴胺能和谷氨酸能神經元。通過對不同分化命運的底板神經母細胞差異表達基因的分析，研究人員發現，Pbx1轉錄因子在偏好產生多巴胺能神經元的底板神經母細胞內顯著高表達（圖E）。當Pbx1被敲除后，共釋放谷氨酸的中腦多巴胺能神經元的比例顯著增加，這證明Pbx1在決定中腦底板來源神經元的谷氨酸能表型和多巴胺能表型中的關鍵作用（圖F）。這些結果展示了CREST技術在克隆水平解析細胞命運決定分子機制中的強大能力。
snapCREST可以解析特定發育時間點不同細胞類型之間的譜系關系，但是由于祖細胞在被用于單細胞測序后無法繼續分化，這一策略無法解析不同祖細胞類型在下一階段的分化命運。為此，研究人員進一步開發了基于CREST的“連拍”策略（pandaCREST）。該策略結合了克隆分離策略、類器官培養技術與CREST技術，實現了發育過程中單個祖細胞轉錄組信息及其分化潛能的同時獲得（圖G）。通過pandaCREST，研究人員解析了中腦不同轉錄組定義的祖細胞群的分化命運。進一步的單克隆分析發現，在同一轉錄組定義的祖細胞群內，單個祖細胞具有不同的分化命運，并且在轉錄組水平上，不同分化命運的祖細胞仍存在微小的差異，提示同一祖細胞類群內單個細胞的不同分化命運是預先確定的（圖H）。
CREST技術是一種高通量譜系示蹤的新方法，它不僅可以在單細胞水平解析體內的發育譜系，而且可以在克隆水平解析發育過程中命運決定的分子機制，是目前已知的唯一可以對腦內任意細胞群體進行高通量譜系示蹤的方法，為解析全腦發育譜系圖譜提供了關鍵技術。通過將CREST 小鼠與任意組織器官或特定類型細胞的Cre/CreER小鼠交配，CREST技術可以被廣泛地應用于其他組織器官的發育譜系研究，并可以用于疾病、損傷或再生條件下的譜系研究。這為在單細胞和單克隆水平研究不同組織器官的發育和疾病發生提供了通用技術方法。
該研究由中國科學院腦智卓越中心博士研究生謝連順與中國科學院營養健康所博士研究生劉恒心，在腦智卓越中心陳躍軍研究員和臨港實驗室魏武研究員的指導下完成。中國科學院腦智卓越中心游致文博士、王露悅博士、李依紋博士、博士研究生章馨月、何慧博士、職工袁停立、鄭文平博士，復旦大學兒科醫院研究生計筱珊，上海躍賽生物科技有限公司吳子彥博士，復旦大學腦科學研究院熊曼研究員，復旦大學周文浩教授，中國科學院腦智卓越中心蒲慕明院士為本研究提供了重要幫助。該研究得到了中國科學院、科技部、基金委和上海市科委的資助。
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